EndoFree Plasmid Mega Kit (5)-质粒纯化 分子生物试剂
EndoFree Plasmid Mega Kit (5)-质粒纯化
纯化得到至多2.5 mg无内毒素超转染级纯质粒或柯斯质粒DNA
得到的DNA内毒素低于0.1 EU/µg
纯化流程快，同时去除内毒素
获得高产量高拷贝质粒DNA
使用LyseBlue，获得的裂解和高产量的DNA
EndoFree Plasmid Kit基于阴离子交换技术，可快速制备不含内毒素的质粒DNA。QIAfilter Cartridges通过过滤快速澄清裂解液，DNA产量至多500 μg（Maxi）、2.5 mg（Mega）和10 mg（Giga）。制备的DNA纯度超过两次CsCl梯度离心法所得DNA的纯度，非常适合超转染级纯的应用。
质粒纯化方法与转染效率。
使用两种方法独立制备pRSVcat，分别使用脂质体介导的方法转染到COS-7、HeLa和LMH细胞中，及使用磷酸钙转染至Huh7细胞中。平均转染效率以相对于QIAGEN Plasmid Kit制备的DNA的转染效率表示。
QIAGEN Plasmid Kit procedures.
Neutralized bacterial lysates are incubated directly in the QIAfilter Cartridge and cleared in seconds by filtration. After the endotoxin removal step, the cleared lysate is then loaded onto the anion-exchange tip where plasmid DNA selectively binds under appropriate low-salt and pH conditions. RNA, proteins, metabolites, and other low-molecular-weight impurities are removed by a medium-salt wash, and ultrapure plasmid DNA is eluted in high-salt buffer. The DNA is concentrated and desalted by isopropanol precipitation and collected by centrifugation.
质粒纯度与转染效率。
图中显示了在无血清条件下，在悬浮液中生长的CHO SSF3 X9细胞中，质粒DNA的数量和质量对转染效率的影响。每个点代表三次独立实验的平均值；Rel. LU：相对光单位。（数据由瑞士巴塞尔诺华公司的M. Zang-Gandor提供。）
细菌细胞壁。
大肠杆菌细胞壁示意图。
EndoFree Plasmid Mega Kit (5)-质粒纯化
EndoFree Plasmid Mega Kit将高效的内毒素去除步骤整合到质粒纯化过程中，不需要额外步骤，也不需用亲和柱去除脂多糖。通过QIAfilter Mega-Giga Cartridge过滤细菌裂解液，通过重力流QIAGEN-tip 2500阴离子交换柱纯化质粒DNA。从500 ml–2.5 l培养液中至多纯化2.5 mg DNA（培养液体积取决于质粒拷贝数量、插入片段大小、宿主菌和培养介质。）纯化的DNA无内毒素（<0.1 EU/µg DNA）。
EndoFree Plasmid Kits去除细菌在裂解过程中释放的内毒素，内毒素会影响原代细胞和敏感培养细胞的DNA转染。从EndoFree Plasmid Kits得到的无内毒素DNA高度适用于可重复且结果可靠的转染。QIAGEN超纯无内毒素DNA也适用于基因治疗研究、基因免疫研究和其他敏感应用。
| 质粒准备方法 | 内毒素(EU†/µg DNA) | 平均转染效率‡ |
|---|---|---|
| EndoFree Plasmid Kit | 0.1 | 154% |
| QIAGEN Plasmid Kit | 9.3 | 100 |
| 2x CsCl | 2.6 | 99% |
| Silica-gel slurry | 1230.0 | 24% |
| DNA 纯化方法 | 转染细胞百分比 |
|---|---|
| EndoFree Plasmid Kit | 21.0% ± 0.93 |
| QIAGEN Plasmid Kit | 8.1% ± 0.57 |
| Silica-gel slurry | 5.2% ± 0.74 |
纯化的质粒DNA内毒素污染水平取决于所用的纯化方法。硅胶技术纯化的DNA具有非常高的内毒素水平。QIAGEN、QIAfilter、HiSpeed Plasmid Kits和两次CsCl超速离心可获得相对低水平内毒素的纯DNA。EndoFree Plasmid Buffer Set包含完整的内毒素去除步骤，获得<0.1 EU/µg的质粒DNA。
QIAfilter、HiSpeed和EndoFree Plasmid Kits提供的QIAfilter Cartridges是特殊设计的过滤装置，用于代替细菌细胞碱裂解后的离心步骤。QIAfilter Cartridges可wanquan去除SDS沉淀，清除细菌裂解液，相比离心可大量节约时间，减少1小时的质粒纯化时间。QIAfilter Mega-Giga Cartridges采用内部真空的方式轻松的澄清大量的细菌裂解物。
QIAGEN-tips中dute的阴离子交换树脂（不提供EndoFree Plasmid Buffer Set）专为核酸纯化而开发。它的分离性能使得DNA纯度与连续两次CsCl梯度离心获得的DNA纯度相当。由重力流驱动并持续运转的预装QIAGEN-tips，限度减少手动制备质粒所需的时间。整个QIAGEN质粒纯化系统不使用有毒物质，如benfen，氯仿，溴化乙锭和CsCl，限度地减少对用户和环境的危害。
内毒素，又称脂多糖或LPS，是革兰氏阴性菌细胞膜的组成部分，如大肠杆菌。内毒素在质粒解裂纯化过程中释放，并显著地降低内毒素敏感的细胞株转染效率。此外，内毒素与DNA竞争“自由"转染试剂，影响转染实验。内毒素也诱导巨噬细胞和B细胞等免疫细胞中非特异性免疫反应，从而导致转染结果的误读。这些反应包括诱导的蛋白质和脂类，如IL -1和前列腺素的合成。总体而言，内毒素在转染实验中是不可控变量，影响结果的可重复性，使它们难以对比、解读。在基因治疗研究中，内毒素可造成内毒素休克综合症和激活补体级联，干扰研究。
在碱性条件下，细菌细胞裂解，用QIAfilter Mega-Giga Cartridge清除粗裂解物。将Endotoxin Removal Buffer加入到过滤后的裂解液中。冰浴后，将纯净的裂解物上样到阴离子交换柱上，在适当的低盐和pH条件下，质粒DNA选择性结合。用中盐缓冲液清除RNA、蛋白质、代谢产物和其他低分子量杂质，超纯质粒DNA被高盐缓冲液洗脱。DNA由异丙醇脱盐、沉淀并且离心回收。
使用EndoFree Plasmid Kits纯化的DNA适合多种敏感应用，包括：
转染，包括原代、敏感和悬浮细胞
基因治疗研究
基因沉默
显微注射
特点 | 参数 |
| Applications | Transfection, gene therapy |
| Culture volume/starting material | 500 ml – 2.5 liters culture volume |
| Plasmid type | High-copy, low-copy, cosmid DNA |
| Processing | Manual (vacuum and centrifugation) |
| Samples per run; throughput | 1 sample per run |
| Technology | Anion-exchange technology |
| Time per run or prep per run | 220 min |
| Yield |
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