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常用生物染色剂--考马斯亮蓝
浏览次数:6465发布日期:2012-07-09

考马斯亮蓝有G250和R250两种,在颜色索引(Colour Index)中给出了不同的编号(42655和42660)。亮蓝G和亮蓝R在冷水中分别为微溶和不溶,在热水和乙醇中分别为可溶和微溶。两种染料均能对固定的蛋白进行有效地染色,使用浓度为溶于甲醇:冰醋酸:水(50:10:40)的0.05%溶液。考马斯亮蓝G250与蛋白质的结合反应十分迅速,是常用的蛋白染料,染色后为蓝绿色,常用来作为蛋白质含量的定量测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质结合虽然比较缓慢,但是燃料可以穿透凝胶,染胶效果好,染色后为红蓝色,且可以被洗脱下去,所以可以用来对电泳条带染色。G250也可染胶,但染色过程慢且染色后背景高,脱色困难。

 
考马斯亮蓝R250(Coomassie brilliant blue R-250)为三苯基甲烷(triphenylmethane),每个分子含有两个SO3-H基团,本身偏酸性,磺酸基与蛋白质的碱性基团结合形成染料-蛋白质复合物。MW=824,λmax=560-590nm。考马斯亮蓝R-250是通过范德瓦尔键与蛋白质结合,可以被洗脱下去,尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色,染色灵敏度比氨基黑高5倍。它与不同蛋白质结合呈现出基本相同的颜色,并且在比较宽的范围内(15-20g),扫描峰的面积与蛋白量呈线性关系。但蛋白质浓度超出一定范围时,对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律,用作定量分析时要注意这点。
 
考马斯亮蓝G250(Coomassie brilliant blue G-250)为二甲花青亮蓝(xylene cyanine brilliant blue),是一种甲基取代的三苯基甲烷。比考马斯亮蓝R250多二个甲基,MW=854;λmax=590-610nm,游离状态下呈红色。染色灵敏度不如R250,但比氨基黑高3倍。其优点在于它在三lvyisuan中不溶而以胶体形式存在,能选择性地和蛋白质形成复合物,染色迅速,着色深的蛋白质区带在数秒内即可显现出来,约45分钟后着色zui深,成本低,重复性好。当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有zui大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1,000μg/mL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
 
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程
  该方法用于大多数蛋白质的定量是比较的,但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。
  1.Bradford浓染液的配制:将100rug考马斯亮蓝G-250溶于50m1 95%乙醇,加入100ml浓磷酸,然后,用蒸馏水补充至200ml,此染液放413至少6个月保持稳定。
  2.标准曲线蛋白质样本的准备:尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品,例如测定抗体,可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的,也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。
  3.将待测样本溶于100~1缓冲溶液中,该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(用PBS)。
  4.按1:5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液,如出现沉淀,过滤除去。
  5.每个样本加5ml稀释的染料结合溶液,作用5~30rain。染液与蛋白质结合后,将由红色变为蓝色,在595nm波长下测定其吸光度。注意,显色反应不得超过30min.
  6.根据标准曲线计算待测样本的浓度。
考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合,反应快速,并且稳定,无法用普通试剂洗掉。待一两周左右,皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。
 
考马斯亮蓝R-250是电泳的
考马斯亮蓝G250和R250都可以染蛋白,一般用R250,G250染色后背景较深不易脱色。 一般R250 染蛋白,G250 一般测蛋白浓度,也可染胶,敏感性更高但较慢脱色较难。

考马斯亮蓝G250常用的蛋白染料,作定性试验用,染色后为蓝绿色;R250较敏感,做定量实验用,染胶效果较好.染色后为红蓝色 。
 

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