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MilliporeECL发光液哪些因素会影响信号的强弱呢?
浏览次数:343发布日期:2022-04-21
  MilliporeECL发光液以化学荧光发光方法检测蛋白质或核酸类生物大分子。其原理是,蛋白质或核酸在电泳后转移到印迹膜上,以抗体及辣根过氧化物酶HRP标记的第二抗体结合膜上的目的蛋白,或以HRP标记的探针直接或间接结合膜上的核酸。洗膜后用MilliporeECL发光液A液和B液等体积的混合工作液,在可见光下室温孵育膜数分钟,将印迹膜用保鲜膜包被粘贴固定于X光片曝光暗盒。然后转入暗室将X光胶片压在膜上曝光数秒到数分钟至数小时。
 
  MilliporeECL发光液哪些因素会影响荧光信号的强弱呢?
 
  1.保鲜膜的质量。a.国产的保鲜膜,很多厂家偷工减料打价格战,造成保鲜膜很薄亦破损。ECL滴加到保鲜膜上容易从肉眼不易分辩的小孔泄露,一方面ECL反应不充分,另一方面ECL所含液体会溶解试验台上残留未知的化学药品颗粒(也许你或其他人曾经不小心打翻过某种化合物)、灰尘等等,造成荧光淬灭。在简述原理时,我曾经提到过很多化合物、金属离子能直接催化过氧化物水解,在极短的时间内消耗掉所有的HRP酶,荧光转瞬即逝。
 
  b.保鲜膜的化工原料或拉制过程中,残留未知的化学试剂,引起荧光淬灭;廉价的保鲜膜问题尤多。
 
  目前,国产的就“妙洁”比较过关,保鲜膜厚度和化学物残留都不影响ECL显影。
 
  如果买不到合格的保鲜膜,也可以用其他物品替代;但要特别注意这些支持物表面的干净,好不要有任何化学试剂残留,包括风干的TBST盐结晶颗粒。
 
  2.ECL孵育结束后膜需要控干。中学物理学过水会吸收光谱,因此任何液体包括ECL溶液本身都会干扰荧光强度,所以ECL孵育结束时需要控干。一般夹起膜,让膜的一角或一边接触吸水纸;但是请注意不能让膜完全干掉。某些信号较弱的ECL,膜彻底干掉后荧光会消失;较好的试剂盒,荧光相对稳定,但完全吸干以后,背景荧光也会升高,而且会严重影响重新标记新抗体时的背景。因此,按照我的方法,让自由流下的多余的ECL被吸走就好。
 
  3.控干的膜要仔细用保鲜膜包被,防止接触外界异物造成荧光淬灭;同时,包裹保鲜膜时要细心,尽量不让正面保鲜膜和膜之间出现皱褶。皱褶的地方会堆积多余的ECL,要么形成一条荧光的亮线;要么由于液体吸收荧光或者局部区域HRP过度消耗,呈线条状淬灭。
 
  4.在膜放入压片夹之前,好肉眼观察一下荧光信号的强弱,这有利于判断实验可能出现的问题。很多人提问看见很强的荧光了,但怎么压片都没有信号,那么就是快速淬灭(闪灭,再怎么快速操作也拿不到这种情况下的荧光信号)造成的;有这个观察至少能够判断ECL孵育之前实验操作应该问题不大,而问题主要是淬灭。如果你省略这个步骤,那问题就非常复杂了,因为之前任何操作都可能导致白板,根本无法判断。
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