如何进行细胞染色

I.细胞的染色例

1. 染色例1

以染色HeLa细胞为例，介绍使用如下试剂的方法

1）. 试剂溶液的配制

配制以下的储备液

Calcein-AM 0.5 mg/ml DMSO solution

BCECF-AM 1 mmol/l DMSO solution

CFSE 1 mg/ml DMSO solution

CytoRed 1 mmol/l DMSO solution

FDA 0.5 mg/ml DMSO solution

PI 1 mg/ml H2O solution

EB 1 mg/ml H2O solution

DAPI 1 mg/ml H2O solution

AO 1 mg/ml H2O solution

* DMSO solution在-20℃的条件下保存,避免失效

2）. 器具

盖玻片 18 mm × 18 mm

培养皿 （直径约35 mm）

镊子

3）. 操作

1） 用5.0 ml PBS（-）溶解10 μl储备液，配制成染色液。

*由于用DMSO溶解的储备液在水溶液中易分解，所以染

色液要现配现用，放置长时间后不能染色。

2） HeLa细胞用Trypsin-EDTA制成细胞悬液。

3） 将细胞悬液离心分离（速度: 1,000 rpm，时间: 3分钟）。

4） 去除上清液，加入PBS（-），控制细胞数量在105-106 个/ml。

5） 用移液枪吹打充分。

6） 在1.5ml微管中加入30 μl第4） 步得到的细胞悬液。

7） 加入15 μl染色液。

8） 盖上盖子，在37℃的条件下，孵育15-30分钟。

9） 取10 μl第8） 步的染色溶液滴加在盖玻片上， 上面再覆盖

另一张盖玻片。

10） 将盖玻片放在荧光显微镜下，用染色试剂对应的激发波

长观察。

2. 染色例2

以MitoRed染色细胞为例，介绍使用如下试剂的方法

1）.试剂溶液的配制

配制以下的储备液

MitoRed 1 mmol/l DMSO solution

（用78 μl DMSO溶解1支50 μg的MitoRed）

*DMSO solution在-20℃的条件下保存，避免失效

2）. 操作

1） 用培养基稀释1 mmol/l 储备液。MitoRed终浓度为：20-

200 nmol/l

*加入到细胞前，推荐先在37℃保温

2） 在细胞培养板上培养细胞 （细胞浓度：1×105- 1×106个

/ml）。

3） 去除培养基，用 （培养基：PBS，Hank,s溶液等）轻轻

地清洗。

4） 将稀释的试剂溶液添加至每孔，在培养条件下，培养

30-60分钟。

5） 去除含色素溶液的培养基，添加新的培养基。

6） 用荧光显微镜观察。

固定细胞的时候，在第4） 步的操作后按以下步骤操作。

5） 去除MitoRed溶液，用不含血清的培养基， PBS，

Hank,s溶液清洗。

6） 用10%中性 福尔马林缓冲液，固定15-20分钟。

7） 用PBS清洗。

8） 用荧光显微镜观察。

图P-7-1 j） 染色HeLa细胞的荧光图像。

3. 染色例3

介绍以Hochest 33258,33342染色细胞为例

1）. 试剂溶液的配制

配制以下的储备液

Hochest 33258 1 mg/ml H2O solution

Hochest 33342 1 mg/ml H2O solution

细胞固定液：1%戊二醛/PBS（-）

培养液：PBS（-）

2）. 操作

1） 将含约1×106个细胞的细胞培养基离心5分钟

（速度：400 x ），去除上清液。

2） 加入100 μl细胞固定液，采用吹打等方法，充分混合。

3） 在室温下静置30分钟。

4） 离心5分钟 （速度：400 x ），去除上清液。加入1 ml

PBS（-）混合后，再离心5分钟 （速度：400 x ）。

*此操作为了充分清洗掉戊二醛，如果存在戊二醛，会导致淬灭。

5） 加入20 μl PBS （-），混合后加入4 μl荧光色素，再混合。

6） 滴1滴细胞染色液在载玻片上，将盖玻片盖在上面。

7） 用荧光显微镜观察。

图P-7-1 k）、I）染色正常人胎儿细胞的荧光图像。